¿Cómo funciona un Microscopio Confocal?

En el anterior post, comentamos sobre que es un microscopio confocal, sin embargo, pudo no haber quedado claro como es su funcionamiento, te lo explicamos.

El funcionamiento del microscopio láser confocal es muy similar al del microscopio de epifluorescencia. Su principal ventaja es que permite obtener imágenes de mayor calidad mediante técnicas de filtrado espacial que eliminan la luz que proviene de planos fuera de foco. Esto permite controlar la profundidad de campo y, además, obtener series de imágenes del espécimen cambiando el plano de foco. Se pueden obtener secciones ópticas de 0.5 a 1.5 micras de especimenes fluorescentes de un espesor de aproximadamente 50 micras o más.

El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por punto y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se necesita una fuente de luz muy potente, así como también un filtro con un agujero que se coloca en el trayecto del rayo de luz (118) (figs. 6-26, 6-27). Minsky lo logró con una lámpara de arco de zirconio, pero en los microscopios modernos se emplea un rayo laser, cuya longitud de onda puede estar disponible en un amplio rango de frecuencias.

El rayo laser es filtrado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen.

Fuente:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_7.htm